cardiomioplastica celullare autologa

Giulio Pompilio, Aldo Cannata, Maurizio C Capogrossi, Francesco Alamanni, Maurizio Pesce, Antonia Germani, Paolo Biglioli

la versione completa di tabelle e bibliografia è consultabile sul sito cardioGenomica


La terapia dell'insufficienza cardiaca è divenuta una delle sfide più impegnative della moderna medicina occidentale. L'impatto che questa patologia ha acquisito in termini di mortalità e di richiesta di ospedalizzazione è infatti in crescita costante, anche a causa dell'aumentata aspettativa di vita. Si stima che tale patologia colpisca lo 0.4-2% della popolazione generale e il 10% degli anziani.

I meccanismi responsabili dell'insufficienza ventricolare sono molteplici: prima fra tutte la cardiopatia ischemica, seguita da affezioni di natura virale, immunopatologica o idiopatica. Il terminale comune di tutte queste patologie è la morte e/o la disfunzione della cellula muscolare cardiaca.

Tra le differenti terapie disponibili rivolte alla cura delle forme più avanzate di scompenso, il trapianto cardiaco e l'assistenza ventricolare meccanica sono attualmente le sole ad offrire la possibilità di modificare drasticamente la storia naturale della malattia. Tuttavia, malgrado costanti progressi scientifici e tecnologici, tali terapie sono ancora caratterizzate da alcuni limiti fondamentali: a) l'impossibilità di rispondere al danno cardiomiocitario irreversibile in termini riparativi; b) l'insorgenza di complicanze non trascurabili, quali le infezioni o i fenomeni tromboembolici nelle assistenze ventricolari e la coronarosclerosi nel trapianto cardiaco; c) i limiti di applicabilità, sia per i costi molto elevati, sia per la penuria di donatori.

I più recenti progressi della biologia molecolare e cellulare hanno aperto una nuova potenziale finestra terapeutica per il trattamento dell'insufficienza cardiaca: il trapianto cellulare, o cardiomioplastica cellulare (CMC).

Cardiomioplastica cellulare: di che cosa si tratta?

Per cardiomioplastica cellulare si intende l'innesto di nuove cellule nel contesto di tessuto miocardico danneggiato, che abbiano la capacità di rigenerare il muscolo cardiaco ripristinando la sua funzione.

Affinché la CMC possa essere utilizzata clinicamente, debbono essere stabilite:

  1. quali sono le linee cellulari più consone per il trapianto: come vedremo, le linee cellulari candidate per CMC sono diverse. Uno degli obiettivi primari è quello di stabilire quali linee cellulari siano più efficaci per l'innesto, anche in relazione al substrato anatomo-patologico bersaglio (area cicatriziale, zona peri-infartuale, aree ischemiche).

  2. quali sono le tecniche più efficaci per l'innesto cellulare: le vie di inoculazione ad oggi ipotizzabili sono: epicardica, endocardica, intracoronarica. I loro limiti e vantaggi sono da mettere in relazione alla possibilità di favorire l'introduzione e la migrazione delle cellule nell'area danneggiata.

Inoltre, da un punto di vista funzionale, i requisiti fondamentali che le cellule innestate debbono possedere sono:

  1. colonizzare il miocardio (integrazione anatomica). Tale requisito è ovviamente condizione fondante qualsivoglia innesto cellulare terapeutico. Ciò implica che le cellule innestate siano in grado di sopravvivere nel tessuto ricevente, sia esso una cicatrice o tessuto muscolare patologico. E' stato ipotizzato che in determinate situazioni di insufficiente apporto ematico, parte delle cellule innestate debbano anche essere in grado di contribuire alla propria vascolarizzazione, con la creazione di nuovi vasi (angiogenesi).

  2. differenziare in senso cardio-miocitario. Le cellule innestate devono possedere una "plasticità" cellulare che permette una loro "riprogrammazione" all' interno del tessuto ricevente.

  3. contrarsi efficacemente (integrazione funzionale). La candidatura dei vari tipi cellulari, come vedremo successivamente, ricade su cellule che abbiano proprietà contrattili, o che possano acquisirle una volta innestate nel miocardio ricevente.

  4. creare un accoppiamento elettro-meccanico con il tessuto miocardico circostante (integrazione elettro-meccanica). Tale requisito è senz'altro difficile da dimostrare. In linea teorica, un cardiomiocita di nuova formazione non soltanto deve contrarsi efficacemente; deve anche poterlo fare in sinergia con il miocardio ospite circostante. Ciò implica che le nuove cellule formino giunzioni intercellulari comunicanti con i cardiomiociti nativi al fine di ricevere lo stimolo elettrico, e che siano in grado di rispondere ad esso. La capacità di accoppiarsi elettromeccanicamente a cellule circostanti può avvenire spontaneamente mediante l' attuazione di un programma differenziativo nella cellula ospite o può essere indotto artificialmente attraverso l' introduzione di geni che favoriscano la formazione di giunzioni comunicanti con i miociti preesistenti.

Le evidenze prodotte in modelli sperimentali suggeriscono che vi sono differenti possibili sorgenti di reperimento di cellule che abbiano le potenzialità di soddisfare in ambito clinico le necessità prima elencate . Di primaria importanza appare di conseguenza nell'uomo la fonte di reperimento cellulare.

Possiamo, per maggiore facilità di descrizione, suddividere le sorgenti di reperimento cellulare potenzialmente utilizzabili in ambito clinico in: allogenica e autologa. La derivazione allogenica prevederebbe l'utilizzo di cellule ricavate da embrioni umani, da feti (donatori cadaveri) o da cordone ombelicale, mentre la derivazione autologa invece utilizzerebbe cellule prelevate dallo stesso paziente destinato a ricevere la CMC.

Cardiomioplastica cellulare allogenica

Per allogenica, si intende una fonte di reperimento geneticamente non identica al ricevente. Allo stato attuale, i tipi cellulari allogenici più sperimentati per prospettive di trapianto nell'uomo sono le cellule staminali embrionali umane, i cardiomiociti fetali o neonatali, e le cellule staminali ematopoietiche da cordone ombelicale.

  1. Cellule staminali embrionali (ES)

    Vi sono sempre maggiori evidenze sperimentali che cellule ES derivate da blastocisti umana (hES) possano essere selezionate e coltivate in vitro. Queste cellule hanno la proprietà di essere "totipotenti", cioè in grado di differenziarsi in vitro ed in vivo in molti tipi cellulari differenti. Recentemente, si è dimostrato che varie linee di ES umane sono in grado di dare origine in coltura a cellule nervose, cellule ematopoietiche e cellule endoteliali . La prima dimostrazione del potenziale cardiomiogenico delle hES è stata data da Itskovitz-Eldor e collaboratori, che hanno selezionato tra i differenti tipi cellulari ottenuti dal differenziamento in vitro delle hES delle cellule simili a cardiomiociti, con capacità contrattili. Seguendo questa linea di ricerca, Kehat e collaboratori  hanno dimostrato la presenza di cardiomiociti in fase precoce di differenziazione ottenuti da colture di cellule staminali di derivazione embrionale. Tali cellule si sono dimostrate avere le proprietà ultrastrutturali, genetiche e funzionali dei cardiomiociti differenziati. 

    Il potenziale vantaggio dell'utilizzazione delle hES rispetto alle cellule staminali adulte è la illimitata capacità di proliferare in vitro e di generare un amplissima gamma di linee cellulari . 

    Tuttavia, il loro impiego clinico è ancora ipotesi sperimentale . Di là da importanti problematiche etiche legate all'utilizzazione di embrioni umani, vi sono anche potenziali significative limitazioni per un impiego terapeutico. Infatti, le hES più indifferenziate possono dare formazione a tumori benigni (teratomi) e maligni (teratocarcinomi) . In secondo luogo, l'aspetto immunologico non è stato ancora approfondito; e non è chiaro se cellule derivate dalle hES in vitro possano dar luogo ad una reazione immunitaria da parte dell'organismo ricevente . Sebbene entrambe queste problematiche potranno in futuro essere risolte con l'ingegneria genetica, che permetterà di selezionare cellule già inizialmente differenziate verso il lineage desiderato e non immunogeniche, l'utilizzo clinico delle hES appare oggi ancora ipotetico.

  2. Cardiomiociti fetali (CF)

    Studi sperimentali hanno dimostrato la fattibilità del trapianto di CF in una cicatrice miocardica. I CF appaiono dopo l'innesto come veri e propri cardiomiociti, con sarcomeri e giunzioni intercellulari composte da desmosomi e fascia adherens . Inoltre, 2 settimane dopo l'impianto, tali cellule compartecipano del supporto ematico del tessuto ricevente . Li e collaboratori hanno dimostrato in preparato isolato di cuore di roditore (modello di Langendorff) che dal punto di vista funzionale il tessuto neo-miocardico formato da CF ha la capacità di contenere l'espansione cicatriziale post-infartuale e migliorare la contrattilità ventricolare . Un'analoga osservazione sperimentale è stata condotta da Scorsin e collaboratori con il trapianto di CF in animali adulti portatori di ischemia miocardica acuta. I parametri emodinamici (frazione di eiezione, indice cardiaco) erano migliori nei roditori sottoposti a cardiomioplastica cellulare con CF rispetto ai controlli. Inoltre, l'area infartuale si dimostrava significativamente ridotta. 

    Tuttavia, sebbene l'impiego di CF a scopo terapeutico appaia dal punto di vista sperimentale molto promettente, rimangono irrisolte le problematiche sovraesposte a proposito delle cellule staminali embrionali: il potenziale immunologico, tumorigeno e infettivo. Gli stessi esperimenti di Scorsin sono stati effettuati in roditori immunosoppressi , mentre Li e collaboratori  hanno dimostrato in animali da esperimento trattati con ciclosporina come si verifichi un certo grado di rigetto dei cardiomiociti fetali innestati nonostante la terapia immunosoppressiva. Infine, non da sottovalutare nel caso di questo modello è la difficoltà di un reperimento quantitativamente significativo per un largo uso clinico di queste cellule.

  3. Cellule staminali da cordone ombelicale umano

    Diversi studi in topi e ratti immunosuppressi hanno mostrato che cellule staminali CD34+ ottenute da sangue di cordone ombelicale umano hanno la potenzialità di colonizzare tessuti ischemici e dare origine a cellule endoteliali e vasi neoformati (19,20). Nostri dati recenti ancora non pubblicati suggeriscono che oltre alla descritta capacità a differenziare verso il lineage endoteliale, le cellule CD34+ del cordone ombelicale umano danno origine a cellule muscolari scheletriche nell' arto ishemico ed in vitro in esperimenti di riaggregazione con mioblasti murini. Ciò suggerisce che queste cellule posseggono una capacità differenziativa superiore rispetto a quanto descritto precedentemente e che esse rappresentano probabilmente cellule in grado di colonizzare con successo il miocardio e differenziare in cardiomiociti.

Le problematiche sovraesposte sono potenzialmente risolvibili solamente con l'uso di cellule geneticamente identiche al ricevente. La cardiomioplastica autologa si propone proprio questo scopo.

Cardiomioplastica cellulare autologa

Per autologa, si intende una fonte di riperimento geneticamente identica al ricevente. In Tabella II vengono riportati i maggiori studi sperimentali che sono stati effettuati con diversi tipi cellulari potenzialmente utilizzabili nell'uomo. Vediamoli in dettaglio:

  1. Cellule staminali isolate dall'individuo adulto

    Le cellule staminali sono cellule indifferenziate con la caratteristica di rinnovarsi e di dare origine ad una progenie di cellule differenziate. Studi recenti hanno dimostrato la presenza di tali cellule in diversi tessuti adulti, come, il sistema nervoso, il muscolo scheletrico, il midollo osseo, il fegato e l'epidermide. Fino a poco tempo fa si riteneva che tali cellule fossero in grado di rigenerare solo il tessuto nel quale risiedevano. Senza entrare in dettaglio, in quanto una descrizione accurata dell'argomento esula dai propositi di questo lavoro, ricordiamo che negli ultimi anni, numerose evidenze sperimentali hanno smentito tale dogma dimostrando come cellule isolate da un determinato tessuto sono in grado di trans-differenziare in cellule di un tessuto di origine diversa. Attualmente le cellule staminali del midollo osseo (CMO) costituiscono una fonte di reperimento molto promettente per CCA in ambito clinico. Il crescente interesse cardiologico nei confronti delle CMO deriva dal fatto che recenti evidenze sperimentali effettuate in vitro hanno dimostrato che esse possono essere indotte a differenziarsi sia in cardiomiociti che in cellule endoteliali di nuovi vasi . Nel midollo si trovano principalmente due differenti popolazioni cellulari: a) le cellule staminali ematopoietiche (CSE) e b) le cellule staminali mesenchimali (CSM). Da studi molto recenti, esisterebbero poi cellule staminali addirittura residenti nel miocardio stesso ( c) cellule staminali cardiache).

    1. Le CSE presentano una elevata plasticità nel generare non soltanto le cellule del sangue, bensì diversi tipi di cellule mature, quali cellule muscolari lisce, cardiomiociti e cellule muscolari scheletriche . Questa loro plasticità è determinata dalla presenza, nell'ambito della popolazione di CSE, di precursori cellulari che possono essere identificati dall'espressione di specifici markers di superficie come le molecole c-kit, CD34 e Sca-1. La possibilità di identificare cellule staminali in base all' espressione di markers di superficie ha permesso di individuare, nel midollo osseo, sotto-popolazioni cellulari con diverso potenziale differenziativo. In particolare è stato dimostrato come cellule c-kit+ e Sca-1+, note anche con il nome di "Side Population" (SP), che costituiscono lo 0.05% delle cellule totali presenti nel midollo osseo, abbiano una elevata capacità di ripopolare il midollo osseo in animali irradiati e di contribuire alla rigenerazione del tessuto cardiaco ischemico . L'espressione del marcatore CD34 identifica invece, le cellule progenitrici di endotelio (EPC) , le quali, in seguito ad ischemia del tessuto scheletrico  o del tessuto cardiaco , e/o a trattamenti con citochine quali il GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor)  e fattori angiogenici (vascular endothelial growth factor-VEGF)  sono mobilizzate dal midollo osseo nel circolo periferico e reclutate a formare nuovi vasi nei tessuti danneggiati. Tali evidenze sperimentali, insieme alla dimostrazione che cellule staminali sono normalmente presenti nel circolo periferico e sono in grado di differenziare in diversi tipi cellulari , offrono la possibilità di sviluppare un nuovo approccio terapeutico non invasivo, per la rigenerazione del tessuto cardiaco.

    2. Le CSM, sono cellule staminali derivate dalla frazione stromale, non ematopoietica, del midollo osseo. Se trapiantate in sede ectopica possono dare origine a tessuti che derivano dal mesoderma embrionale, come tessuto adiposo, tessuto connettivo e il tessuto reticolare di supporto dei vasi sanguigni. In realtà la plasticità di tali cellule è ben più ampia in quanto, studi recenti dimostrano che le CSM sono in grado di generare cellule derivanti da un foglietto embrionale diverso dal mesoderma, come le cellule neuronali  e cardiache. Sulla base di tali evidenze sperimentali e considerata la relativa facilità di isolamento e di espansione in coltura delle CSM, è naturale ritenere queste cellule tra i migliori candidati da poter utilizzare per fini terapeutici volti alla ricostruzione di diversi tessuti.

    3. Cellule staminali cardiache. Per lungo tempo si è ritenuto che le cellule cardiache adulte, fossero terminalmente differenziate, incapaci di rinnovarsi e pertanto di rigenerare il miocardio. Tale dogma è stato recentemente demolito da una recente pubblicazione  in cui gli autori mostrano la presenza di cardiomiociti proliferanti nel miocardio infartuato. Ma quale è l'origine di tali cellule? Una risposta a questa domanda è stata fornita da Quaini e collaboratori i quali hanno individuato cellule staminali, c-kit+, Sca-1+ e MDR1+, nell'atrio e nell'apice del ventricolo del miocardio. L'identificazione di tali cellule è il risultato di una serie di esperimenti volti a caratterizzare il fenomeno del chimerismo, nei trapianti cardiaci. Analizzando cuori umani trapiantati in individui di sesso maschile e provenienti da individui di sesso femminile mediante una tecnica che permette di evidenziare il cromosoma Y, la presenza di cellule del recipiente sono state identificate all' interno del cuore trapiantato dimostrando, dunque, il fenomeno del chimerismo. Tuttavia la maggior parte delle cellule c-kit+ e MDR1+ non erano Y+, suggerendo l'ipotesi che cellule staminali cardiache risiedano nel miocardio.

    Studi Sperimentali
    Linee cellulari a potenziale cardiomiogenico sono state isolate per la prima volta da cellule stromali del midollo osseo di murena. Tali cellule, opportunamente coltivate in vitro e trattate con 5-azacitidina, un agente demetilante analogo della citosina, in grado di alterare l'espressione di geni coinvolti nel differenziamento muscolare , si sono rivelate capaci di creare giunzioni intercellulari con le cellule circostanti, di contrarsi, formando strutture intracellulari simili a miotubuli, e di battere in sincronia, rispettivamente dopo 1, 2 e 3 settimane dall' inizio del trattamento in vitro. L'osservazione ultrastrutturale ha rivelato la presenza di sarcomeri e organelli intracellulari simili ai cardiomiociti. E' stata inoltre osservata una positività ad anticorpi per miosina cardiaca, desmina ed actina. L'analisi delle isoforme delle proteine contrattili ha rivelato che tali cellule possiedono un pattern di espressione genica simile a cardiomiociti in fase di differenziazione (ad esempio, l'espressione di geni regolatori della cardiogenesi quali il MEF-2A e il MEF-2C).

    I modelli sperimentali hanno permesso di definire anche il ruolo delle CMO nella CMC autologa. Ad esempio, Jackson e collaboratori  hanno trapiantato cellule staminali ematopoietiche in topi irradiati che sono stati successivamente sottoposti a legatura dell'arteria coronaria interventricolare anteriore (IVA). La successiva analisi del tessuto infartuale ha rivelato la presenza delle CSE del ricevente, suggerendo che le cellule staminali erano state mobilizzate dal midollo ed indotte a colonizzare il miocardio da non precisati fattori di mobilizzazione e reclutamento all'interno della lesione infartuale.

    Risultati ancora più promettenti si sono ottenuti con inoculazione diretta intramiocardica. Orlic e collaboratori  hanno utilizzato CSE per CMC autologa diretta nel topo. Il modello utilizzato è quello infartuale attraverso la legatura dell'IVA. Cellule staminali purificate per mezzo di un marker cellulare di superficie (Lin-c-kitPOS), sono state iniettate nel miocardio periinfartuale. Nove giorni dopo l'impianto, si è osservata la formazione di neo-cardiomiociti, di endotelio vascolare e di cellule muscolari lisce. Il risultato è quindi la creazione di nuovo tessuto miocardico, comprensivo di letto vascolare (arteriole e capillari). Tale rigenerazione interessa fino al 68% della preesistente area infartuale. Inoltre, la sopravvivenza dei topi sottoposti a cardiomioplastica cellulare si dimostra essere superiore ai controlli. In un precedente studio, Tomita e collaboratori , utilizzando un modello di lesione a frigore (-190 °C con azoto liquido) del miocardio, avevano dimostrato che cellule progenitrici del midollo precedentemente trattate con 5-azacitidina e successivamente impiantate nella lesione si differenziavano in cellule muscolari cardiache, con espressione tipica di catene miosiniche pesanti e troponina-I. Da un punto di vista funzionale, i cuori sottoposti a CMC autologa possedevano rispetto ai controlli una funzione cardiaca migliore in termini di lavoro ventricolare. Inoltre, le cellule impiantate erano in grado di indurre angiogenesi nella cicatrice infartuale, provvedendo a produrre i substrati necessari per la creazione di un letto vascolare.

    Dalle suddette evidenze sperimentali appare quindi come le CMO abbiano un grande potenziale terapeutico per la rigenerazione del tessuto miocardico danneggiato, essendo in grado di differenziarsi sia in cardiomiociti che in neovasi, potendo quindi essere impiegate sia con finalità riparative, che di rivascolarizzazione. Un importante contributo a questa teoria è stato fornito da Kocher e collaboratori (38). Utilizzando cellule staminali ematopoietiche in un modello infartuale di ratto, essi hanno isolato le frazioni di CSE coinvolte nel processo riparativo ed angiogenico, identificate con i marker di superficie cellulare CD34 e CD117 (EPC). L'impiego associato di tali sottopopolazioni ha contemporaneamente permesso di ridurre l'area cicatriziale e la deposizione di collagene, e di migliorare l'apporto ematico della zona periinfartuale. Quindici settimane dopo l'infarto, la percentuale di cicatrice rispetto al tessuto vitale era del 13% negli animali sottoposti a cardiomioplastica cellulare con ASC, contro il 36-45% dei controlli.

    Hamano e collaboratori  hanno recentemente utilizzato un modello di ischemia/infarto cronico nel cane, con impianto autologo di cellule prelevate dal midollo osseo. Tale studio pre-clinico ha dimostrato che l'impianto di CMO prelevate dalla cresta iliaca e purificate è in grado, rispetto a controlli, di ispessire la regione miocardica cronicamente ischemica, e l'esame isologico ha evidenziato un aumento del numero dei capillari. Dal punto di vista funzionale, l'analisi ecocardiografica non ha permesso invece di evidenziare un incremento significativo della contrattilità ventricolare. Gli Autori hanno concluso che le CMO impiantate con questa tecnica hanno proprietà cardiomiogeniche ed angiogeniche, pur non essendo probabilmente così numerose da incidere sulla funzione contrattile dell'area ischemico/infartuale. Un secondo studio preclinico molto interessante è stato recentemente condotto da Tomita e collaboratori , utilizzando un modello infartuale nel maiale. Cellule staminali mesenchimali sono state aspirate dallo sterno, coltivate ed incubate con 5-azacitidina. Una volta inettate nella regione infartuale, le CSM hanno dato luogo dopo 4 settimane dall'impianto a isole di neo-cardiomiociti (con sarcomeri, bande Z e positività per Troponina I), supportate da una rete vascolare, in grado di ispessire significativamente la regione cicatriziale. Dal punto di vista dell'emodinamica cardiaca, si è inoltre notato che i cuori sottoposti a CMC sviluppavano un lavoro cardiaco maggiore rispetto ai controlli, con volumi sisto-diastolici indicativi di un minore rimodellamento post-infartuale. Questo studio dimostra quindi che la CMC con CMO è potenzialmente efficace nel migliorare la funzione ventricolare nella cardiopatia dilatativa ad eziologia ischemica.

  2. Cellule muscolari (CM)

    Una seconda interessante fonte per CMC nell'uomo è rappresentata dalle cellule muscolari scheletriche e lisce. La facilità di reperimento e la possibilità di espansione in vitro ha fatto di queste cellule la prima fonte di utilizzazione per CMC dapprima in animale da esperimento, e più recentemente, anche in ambito clinico.

    Un promettente tipo cellulare di precursori di cellule muscolari scheletriche (CMS) di potenziale utilizzo clinico sono le cellule satelliti. Si tratta di cellule staminali miogeniche che si trovano in prossimità della lamina basale delle miofibrille, coinvolte nei meccanismi di rigenerazione muscolare dopo traumi. L'interesse per tali cellule deriva dalla facilità con cui possono essere isolate da biopsie muscolari ed quindi utilizzate nell'uomo per CMC autologa e dalla recente evidenza che precursori miogenici con un potenziale differenziativo più ampio, sono presenti nel midollo osseo . Cellule satelliti isolate e trapiantate nel miocardio hanno dimostrato di possedere alcune caratteristiche istologiche simili ai cardiomiociti  e di contrarsi efficacemente. Un ulteriore vantaggio offerto dalle CMS è la capacità di acquisire resistenza alla fatica, modificando le caratteristiche delle proteine contrattili .

    D'altro canto, l' impossibilità dei miociti di origine scheletrica a stabilire giunzioni di tipo comunicante (gap junctions), fa supporre che queste cellule non possano accoppiarsi elettro-meccanicamente con i cardiomiociti e che quindi la loro funzione si esplichi essenzialmente a livello meccanico (ispessimento della cicatrice infartuale) più che meccanico-funzionale (contributo alla contrazione).

    Studi Sperimentali
    Un importante modello sperimentale di CMC con CMS è stato messo a punto da Taylor e colleghi . Essi hanno trapiantato da fonte autologa mioblasti scheletrici nel miocardio di coniglio, una settimana dopo criolesione transmurale. I risultati sono stati parzialmente incoraggianti per quanto riguarda attecchimento e funzionalità: in 7 conigli su 12 si è osservato l'attecchimento delle CMS. L'analisi istologica ha dimostrato isole di strutture miotubulari nel contesto della regione cicatriziale, con positività alla miogenina, caratteristica delle cellule trapiantate. In un gruppo più ristretto (5 animali) la funzione ventricolare sistolica e diastolica risultava significativamente migliore rispetto ai controlli. Tuttavia, un reperto controverso di questa serie di esperimenti è stata la relativamente scarsa quantità di cellule muscolari scheletriche isolate nel contesto del miocardio sottoposto a trapianto, rispetto alla presenza di cellule con caratteristiche di cardiomiociti. Gli Autori hanno sostenuto l'ipotesi della differenziazione non terminale delle CMS, che in un milieu miocardio sarebbero capaci di trasformarsi in cellule cardiache. A corroborare questa tesi, lo stesso gruppo, con un modello di infarto nel coniglio, suggerisce la possibilità della differenziazione di cardiomiociti immaturi dalle CM impiantate (reperiti alla periferia dell'impianto cellulare).

    Tuttavia, senza addentrarci in difficili disquisizioni sulla natura dei cardiomiociti immaturi nel contesto di tessuto riparativo (si pensi alle recenti tesi sulle cellule staminali miocardiche), sembra improbabile una tale ipotesi. Vi sono infatti fondamentali differenze di struttura tra i miociti scheletrici e quelli cardiaci, che rendono problematica l'integrazione funzionale delle CMS nel miocardio. La prima differenza è la mancanza di giunzioni intercellulari di tipo gap junctions nelle CMS (47, 48); la seconda riguarda l'isoforma del recettore diidropiridinico (DHPR), responsabile della trasformazione dell'impulso elettrico in contrazione meccanica . Queste differenze rendono evidentemente impossibile alle cellule muscolari scheletriche un accoppiamento elettro-meccanico nel contesto del tessuto miocardico. D'altra parte, un dato a favore delle CMS è la dimostrazione di una alta resistenza nel contesto del tessuto miocardico. In modello canino di trapianto autologo, esse sono state trovate vitali a 3 mesi dall'impianto . 

    Studi sperimentali di CMC autologa sono stati condotti anche utilizzando cellule muscolari lisce (CML). Queste possono facilmente essere prelevate e coltivate in vitro, avendo anche la capacità di produrre fattori angiogenici come il VEGF e quindi di stimolare una rete vasale di supporto. Il gruppo di ricerca di Toronto  ha impiantato CML in cavie con cardiomiopatia dilatativa, valutando a 4 settimane la funzione ventricolare sinistra in cuore isolato. Rispetto ai controlli, i cuori sottoposti a CMC dimostravano un incremento significativo del lavoro ventricolare ed una diminuzione dei volumi. Le CMS tuttavia hanno le stesse limitazioni funzionali delle cellule muscolari scheletriche per una integrazione elettrica con i cardiomiociti circostanti. 

    Studi clinici
    Precursori di cellule muscolari scheletriche (cellule satelliti) sono state le prime linee cellulari utilizzate per CMC nell'uomo, grazie alla facilità di prelievo e di coltura ed alle incoraggianti evidenze sperimentali. Pioniere di queste ricerche è il gruppo di P. Menasché, a Parigi. Cellule muscolari scheletriche autologhe (a larga percentuale mioblasti) prelevate dal muscolo vastus lateralis, ed opportunamente coltivate in vitro, sono state impiantate nel contesto di cicatrice infartuale della parete ventricolare posteriore, con iniezione intramiocardica, in paziente portatore di insufficienza cardiaca congestizia (frazione di eiezione ecocardiografica bidimensionale (FE): 21%). La procedura è stata effettuata contestualmente all'esecuzione di by-pass coronarici. Cinque mesi dopo l'intervento, i controlli hanno dimostrato un incremento della FE globale (30%) e una ripresa della contrazione in parete posteriore (sede di CMC). Inoltre, uno studio PET ha dimostrato un moderato aumento di attività metabolica nel contesto della parete posteriore trapiantata . Questi preliminari dati clinici suggeriscono che nell'uomo la CMC con CMS ha fornito incoraggianti risultati. Naturalmente, come sottolinea lo stesso Menasché, rimangono interrogativi aperti a riguardo della effettiva capacità delle CM a partecipare sinergicamente della contrazione ventricolare e del destino delle cellule muscolari trapiantate nel lungo periodo.

  3. Cardiomiociti (CA)

    La terza promettente linea cellulare per utilizzo clinico in cardiomioplastica autologa è ovviamente rappresentata dalle stesse cellule muscolari cardiache mature. In linea teorica, il prelievo autologo di CA nel cuore umano è possibile sia durante intervento cardiochirurgico, sia con prelievo bioptico, rendendo i CA una sorgente cellulare percorribile in ambito clinico. 

    Studi sperimentali
    L'uso di CA adulti eviterebbe le limitazioni pratiche ed etiche legate all'utilizzo di cardiomiociti fetali. Il gruppo di ricerca di Toronto ha largamente utilizzato, in analogia con gli esperimenti effettuati con cardiomiociti fetali, CA prelevati da animali adulti per CMC in modelli di cardiopatia ischemica e dilatativa. Nei ratti, cellule miocardiche atriali autologhe adulte espanse in coltura sono state impiantate in aree miocardiche danneggiate da criolesione . I CA atriali sono stati capaci di sopravvivere nel tessuto cicatriziale, limitando l'espansione della necrosi e migliorando la performance ventricolare rispetto ai controlli. Tuttavia, tali cellule non hanno dimostrato proprietà contrattili, e la capacità di allinearsi come cardiomiociti nativi all'interno della cicatrice, comportandosi similmente alle cellule muscolari scheletriche. Osservazioni analoghe sono state condotte con il trapianto di CA adulti su cuore isolato di cavia con cardiopatia dilatativa. 

    In seguito, lo stesso gruppo ha condotto un promettente studio pre-clinico su maiale con un modello sperimentale di necrosi/ischemia e contemporaneo prelievo bioptico settale di CA autologhi . Tali cellule, coltivate ed espanse, sono state direttamente iniettate nell'area necrotica. Sebbene l'osservazione in vitro non era stata in grado di rivelare proprietà contrattili, l'analisi ultrastrutturale ed immunoistochimica confermava le caratteristiche di normali cardiomiociti. Un'analisi scintigrafica (SPECT) effettuata dopo l'impianto ha evidenziato, rispetto ai controlli, una maggiore perfusione e aumentati indici di contrattilità regionale nel contesto della cicatrice iatrogena negli animali sottoposti a CMC autologa. 

    I CA possiedono tuttavia alcune limitazioni legate alla difficoltà di prelievo, di coltura ed espansione in vitro, nonché al reale potenziale terapeutico dopo l'impianto. Uno studio comparativo effettuato su cuore isolato di cavia tra CA e cellule muscolari lisce in modello di cardiopatia dilatativa, ha infatti evidenziato una possibile superiorità delle CML nel migliorare la funzione ventricolare.

Considerazioni finali

Dai dati in nostro possesso emerge che ogni linea cellulare proposta per CMC autologa offre vantaggi e limiti peculiari in vista di un impiego clinico.

Le cellule muscolari scheletriche sono facilmente reperibili ed espandibili in coltura. Tuttavia, non è chiaro se se esse siano in grado di integrarsi anatomicamente e funzionalmente con il tessuto cardiaco circostante, creando una rete vascolare di supporto e giunzioni intercellulari atte ad una loro contrazione sincrona con il battito cardiaco. Non è chiaro inoltre se possano differenziarsi in vere cellule cardiache o siano altrimenti in grado di riprogrammarsi in cellule resistenti alla fatica.

I cardiomiociti autologhi sono teoricamente cellule perfette per CMC. Tuttavia è complesso il loro prelievo (biopsia endocardica) e l'espansione in vitro. Gli esperimenti sono stati finora condotti con sole cellule fetali, che pongono sia problemi di rigetto che etici. Le cellule staminali cardiache (qualora potessero essere isolate ed espanse in vitro) potrebbero rappresentare una interessante fonte autologa per impiego clinico.

Le cellule staminali di derivazione dal midollo osseo sono la scoperta più recente. Sebbene la loro utilizzazione appaia promettente (relativa facilità di prelievo autologo e capacità sperimentale di trans-differenziazione in cardiomiociti ed endotelio), rimangono molti punti da chiarire in merito al loro reale potenziale differenziativo nell'uomo.

Per tutte le linee cellulari, sono poi necessari studi approfonditi per analizzare l'effettiva funzionalità e capacità di sopravvivenza nel tempo nel contesto del tessuto miocardico danneggiato.

Infine, per ogni trasferimento cellulare sarà importante stabilire il numero ottimale di cellule da iniettare. Benché nella maggioranza degli esperimenti il numero di cellule iniettate si aggiri su diversi milioni, tale numero è probabilmente insufficiente a generare un incremento di funzione ventricolare clinicamente rilevabile. Come suggerito dagli studi di Anversa e collaboratori , il successo della CMC sembrerebbe piuttosto dipendere dalla capacità delle cellule (nel caso specifico cellule staminali) di proliferare autonomamente nel tessuto miocardico.

Appare evidente quanta ricerca aggiuntiva allo stato delle nostre conoscenze sia oggi necessaria.

Il Futuro?

Sulla scorta delle evidenze sperimentali e dei pionieristici tentativi in ambito clinico, la CMC autologa non sembra essere soltanto un sogno di pochi ricercatori. Certamente, in ambito clinico, tutto deve ancora essere dimostrato. Tuttavia, si possono fin da ora prevedere quali saranno i punti "strategici" sui quali si concentreranno i prossimi studi clinici e sperimentali:

In conclusione, la cardiomioplastica cellulare è una materia complessa ed in continua evoluzione, che ha la potenzialità di offrire nuove prospettive al paziente cardiopatico. Il suo trasferimento in ambito clinico appare oggi auspicabile sulla base dei dati a nostra disposizione. Soltanto la perseveranza e la serietà dei ricercatori permetteranno di raggiungere nel prossimo futuro le risposte che attendiamo.



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questa pagina e' stata aggiornata  giovedì 05 gennaio 2006
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